Macchiarsi occidentale è una tecnica di biotecnologia per la rilevazione di una proteina specifica in un campione. Si tratta di separazione delle proteine di dimensioni e carica, mediante una procedura chiamata elettroforesi del gel; loro trasferimento ad una membrana PVDF o nitrocellulosa; e l'aggiunta di anticorpi primari. Se la proteina di interesse è presente, si legano ad esso.
Infine, il ricercatore aggiunge anticorpi secondari che si legano agli anticorpi primari. Gli anticorpi di secondarty portano un enzima che emette luce in presenza della proteina; la quantità di luce che emettono riflette la quantità di proteina nel campione.
Restore è un marchio della macchia stripping buffer che è possibile utilizzare per rimuovere gli anticorpi primari e secondari, se avete bisogno di ri-sonda il campione.
Istruzioni
• Riscaldare la bottiglia di ripristinare Western Blot Stripping Buffer 21059 fino a quando è a temperatura ambiente. Lasciando la bottiglia fuori per diverse ore, o durante la notte, lo porterà a temperatura ambiente. Se necessario, è possibile controllare con un termometro.
• Lavare la macchia con tampone di lavaggio per rimuovere qualsiasi substrato chemiluminescente che rimane dal primo sondaggio. Aggiungere sufficiente ripristinare Western Blot Stripping Buffer bagnare completamente la macchia. Il produttore consiglia 20 millilitri come un importo appropriato per una macchia di 8-10 centimetri.
• Incubare la macchia con il tampone a temperatura ambiente. Se gli anticorpi usato per sondare la macchia erano ad alta affinità, potrebbe essere necessario Incubare la macchia alla temperatura leggermente più alta di 37 gradi Celsius (98,6 gradi Fahrenheit) e concedere più tempo. In generale, però, 5-15 minuti dovrebbe essere sufficienti a rimuovere entrambi gli anticorpi primari e secondari.
• Aggiungere il substrato perossidasi di rafano a chemiluminescenza per la macchia e mettere un foglio di pellicola fotografica sulla membrana. Il film cambierà colore ovunque luce lo colpisce. Se la pellicola fotografica non ha rilevato alcuna luce emessa dal campione dopo 5 minuti, è stata rimossa l'anticorpo secondario e suo enzima coniugato.
• Aggiungere l'anticorpo secondario per la macchia. Lavare la macchia nel tampone di lavaggio ed esporlo nuovamente a pellicola fotografica, appena come nel passaggio 4.
Se non vedete un cambiamento dopo 5 minuti, aver rimosso l'anticorpo primario e può ri-sonda la macchia per convalidare i risultati precedenti.
Se non hai rimosso con successo sia l'anticorpo primario o secondario, ri-Incubare il blot nel rimuovere Western Blot Stripping Buffer, come descritto nei passaggi 2 e 3. Consentire un ulteriore 5-15 minuti garantire la rimozione di entrambi gli anticorpi primari e secondari e quindi ripetere i passaggi 4 e 5.
Consigli & Avvertenze
- È importante per incubare la macchia abbastanza a lungo per rimuovere tutto l'anticorpo primario e secondario, ma non abbastanza a lungo per danneggiare la proteina di interesse. In generale, 5-15 minuti dovrebbe essere sufficiente; a seconda della proteina che si sta lavorando con, tuttavia, ci possono essere eccezioni.
- Mai condurre un esperimento di questo tipo senza indossare adeguate dotazioni di sicurezza (ad es., schizzi di prodotti chimici occhiali, guanti, camice da laboratorio) e seguendo del tuo laboratorio protocolli di sicurezza e le procedure.