Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è una tecnica per ottenere informazioni circa la reazione di due molecole. Una soluzione di una biomolecola viene iniettata più volte in una soluzione contenente il suo partner di associazione. Il calore assorbito o rilasciato durante la loro reazione è monitorato registrando la quantità di energia della macchina ITC utilizza per mantenere la soluzione di reazione ad una temperatura di riferimento. La lettura ITC produce picchi corrispondenti a ogni iniezione e questi possono essere integrati per misurare la quantità di calore risultante dalla reazione, che è direttamente correlata all'affinità di legame di due molecole.
Istruzioni
Preparare l'esperimento per evitare di dati non validi
• La macchina ITC contiene una cella di riferimento che viene riempita con acqua o buffer per fornire la temperatura di riferimento e una cella di reazione che contiene una molecola per essere studiato. Un buffer è una soluzione in grado di mantenere il pH stesso (livello di acidità) quando vengono aggiunte piccole quantità di composti ad esso. Sciogliere ogni partner di associazione nello stesso buffer. Un pH-metro con precisione le misure tampone pH. Controllare il pH delle soluzioni reazione per garantire che siano quanto più possibile vicini. Questo eliminerà il rumore di fondo che può interferire con o mascherare cime la lettura.
• Degassare tutti i campioni prima di aggiungerli alla macchina ITC. Questo ridurrà di bolle d'aria e rumore di fondo di aiuto controllo o picchi supplementare nella vostra lettura ITC.
• Sostituire la siringa di iniezione se è piegato. Questa siringa è utilizzata per iniettare una molecola la cella contenente il suo partner di associazione.
• Aggiungere un livello sufficiente di liquido nella cella di riferimento per garantire che il livello basale della lettura non è troppo alto. Sciogliere completamente il buffer prima di aggiungerli alla cella per evitare un livello basso della linea di base.
Dati poco chiari risoluzione dei problemi
• Prova diverse concentrazioni di entrambe le molecole di trovare le condizioni di reazione ottimale per la vostra reazione. Un rapporto molare 1:1 dovrebbe essere raggiunto dopo le iniezioni successive.
• Aumentare il tempo tra le iniezioni se la linea di base sembra essere alla deriva. La linea di base deve essere costante.
• Aumentare il riferimento offset se letture energetiche sono sotto lo zero.
• Cambiare la temperatura dell'esperimento da 5 a 10 gradi Celsius fino a quando sono osservati picchi abbastanza grande se non viene rilevato nessun livello di energia. La reazione è classificata come debole o inesistente se nessun livello di energia viene rilevato dopo la regolazione della temperatura.
Corretta pulizia assicura buoni dati
• Lavare la siringa con maggiore di 50 ml di acqua dopo il completamento degli esperimenti. Questo farà in modo che nulla precipita nella siringa e interferisce con l'esperimento successivo.
• Lavare accuratamente la cella del campione con acqua utilizzando una siringa di long-ago. Questo consentirà di evitare vecchi campioni di precipitazione nella cella e vada ad interferire con l'esperimento successivo.
• Lavare la cella del campione con un detergente compatibile con la macchina. Controllare il manuale di istruzioni per un elenco di detergenti compatibili.