Protocollo di rinaturazione

Protocollo di rinaturazione

Denaturare una proteina, o interrompere la sua originaria struttura tridimensionale, è spesso inevitabile nel corso di estrazione e isolandola da altri componenti cellulari. Poiché la struttura di una proteina è solitamente essenziale per la propria funzione, è necessario "rinaturazione" o ripiegare una proteina una volta che è isolato. Anche se condizioni adeguate per una proteina di rinaturazione dipenderà da fattori quali le dimensioni, la solubilità e la conformazione nativa, alcuni principi generali sono validi in tutti i casi.

Rimozione dell'agente denaturante

Protocollo di rinaturazione

Urea sconvolge legami proteina-proteina.

In tutti i casi, è necessario eliminare l'agente che ha causato la proteina a svolgersi in primo luogo. Urea e guanidinio cloruro sono denaturazione agenti, sostanze chimiche che rompono fino legami non covalenti, come quelli che stabilizzano la conformazione di una proteina e sono spesso aggiunti alle soluzioni di denaturazione. Queste piccole molecole possono essere rimosso dalla soluzione della proteina di dialisi o cromatografia, o in alcuni casi la concentrazione dell'agente denaturante può essere diminuita sufficientemente semplicemente diluendo la soluzione con il tampone fresco.

Identificano un Buffer Refolding

Protocollo di rinaturazione

Trovare un buffer che funziona per una certa proteina può essere un passo impegnativo.

Con il denaturante rimosso, la proteina può formare ancora una volta i legami non covalenti che stabilizzano la sua struttura tridimensionale. Purtroppo, i legami che si formano possono essere diversi da quelli originali, provocando diverse conformazioni o grandi aggregazioni delle proteine. Come l'agente denaturante viene rimosso, la proteina deve incontrare un buffer in cui ri-assumendo la conformazione nativa è energicamente preferito; Purtroppo, non esiste attualmente alcun modo per sapere aprioristicamente quale ricetta di buffer è adatto per quale proteina. Al contrario, numerosi buffer spesso vengono proiettati in parallelo e la conformazione risultante in ogni rispetto alla struttura nativa. Kit disponibili in commercio possono facilitare questo processo di screening.

Altri fattori

Protocollo di rinaturazione

Temperatura può essere un fattore in ripiegamento di proteine.

La probabilità di successo rinaturazione può essere migliorata osservando alcune regole empiriche. Soluzioni proteiche diluite (10 a 100 microgrammi per millilitro) sono meno probabili aggregare al ripiegamento in quanto più concentrato soluzioni. Temperatura deve essere controllato attentamente e spesso possibile scomporre nel processo come parametro; temperature inferiori o superiori (nella gamma di quattro a 37 gradi Celsius) possono essere testate per il loro effetto. In generale, che riproduce le condizioni in cui la proteina piegata originariamente è spesso utile: per esempio, le proteine di membrana, che originariamente ha preso la loro forma in presenza di un doppio strato lipidico, possono essere rinaturalizzato in una soluzione contenente liposoma.


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