Durante l'associazione di acidi nucleici o proteine, un materiale di alta-associazione chiamato membrana PVDF (difluoruro di polivinile) fornisce il supporto per gli anticorpi. Tramite Western blotting, le membrane sono accatastate insieme, preparate per l'anticorpo e poi asciugate. Protocollo per l'essiccazione della membrana richiede la conoscenza di come funzionano le membrane, catodo, anodo le piastre e applicazione di soluzioni di metanolo. Con il protocollo corretto, la membrana in modo sicuro si lega con l'anticorpo specifico ed è pronta per l'uso immediato o deposito.
Preparazione della membrana
Preparando la membrana PVDF pulisce e stabilizza la membrana prima del trasferimento. Prima dell'essiccazione, la membrana è "bloccata" per impedire l'associazione da qualcosa di diverso da acidi nucleici specifici, quali gli anticorpi non specifici. Durante questa procedura, hai bagnato la membrana distesa su una superficie piana rivestita in metanolo. La membrana cambia colore durante questa frase, da opaco a semitrasparente. Una volta finito con il bagno di metanolo, la membrana è posizionata in acqua deionizzata in ammollo per circa due minuti. La membrana deve quindi immergere nuovamente in una soluzione di metanolo che è molto acida.
Assemblaggio delle membrane prima del trasferimento
Due delle carte della membrana sono inzuppati nella prima soluzione di metanolo e posta su una piastra di anodo. Durante questo processo, è necessario verificare attentamente per bolle d'aria intrappolate, che potrebbe compromettere il trasferimento. Un altro pezzo di carta da filtro è impregnato nella seconda soluzione di metanolo e collocato in cima alla pila. Un gel quindi va in cima la membrana, con attenzione a non intrappolare bolle d'aria tra la membrana e applicazione di gel. Tre nuovi pezzi di carta sono quindi imbevuti in un buffer di catodo e posizionati sopra il gel. In caso di eventuali bolle di aria, una provetta lavora per appianare le membrane.
Trasferimento
In questa parte del processo, è collegare i cavi ad alta tensione di un alimentatore e applicare una corrente costante alla zona di gel sulla membrana per 30 minuti. Tempi di trasferimento variano a seconda del tipo di anticorpo. Dopo 30 minuti, potete rimuovere il cavo di alimentazione e trasferimento della membrana. L'angolo inferiore destro della membrana viene poi tagliata per controllare l'orientamento. Vengono scartati i primi due strati della carta da filtro, tra cui il gel. Le bande del peso molecolare sono contrassegnate con una penna a sfera.
Essiccazione
Una volta completato il trasferimento, è necessario asciugare la membrana in uno dei due modi. Per una più veloce asciugatura, la membrana è imbevuta di metanolo al 100% per 10 secondi per rimuovere l'eventuale acqua. La membrana si basa quindi su un pezzo di scottex per 15 minuti. Per un metodo più lenta essiccazione, la membrana è posizionata sul tovagliolo di carta senza l'aggiunta di metanolo. Una volta asciugata, la membrana può essere utilizzata o memorizzata in un contenitore asciutto a 4 gradi Celsius per uso futuro.