Protocolli di Elisa concorrenza

Il test ELISA è un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente che utilizza anticorpi o antigeni accoppiato ad un enzima specifico per contribuire a misurare la concentrazione dell'anticorpo o antigene. Se fate un test ELISA e non siete in grado di utilizzare gli anticorpi specifici per indirizzare la vostra misura, il test ELISA competitivo è suggerito per uso perché utilizza un antigene enzima-collegato invece l'anticorpo e un metodo di rilevazione diverse.

Misura tramite cambiamenti di colore

Un protocollo comune per ELISA competitivo sta usando l'anticorpo primario purificato adenoide. L'anticorpo è coattato dei pozzetti di una piastra per microtitolazione e incubato con campioni sconosciuti. Immunogeno viene quindi aggiunto al coniugato con l'anticorpo primario, dove si lega per i siti di legame dell'anticorpo che non sono già occupati dal immunogen sconosciuto. Un substrato viene quindi utilizzato per creare un cambiamento di colore per la misura della concentrazione di associazione.

Utilizzando un lettore ELISA per la misurazione

Utilizzare una piastra in polistirene-micro e aggiungere l'anticorpo primario in ciascun pozzetto della piastra. Per acquisire il massimo di rilegatura, riempire il pozzetto con un microgrammo dell'anticorpo. Incubare la piastra per quattro ore a temperatura ambiente. Aggiungere l'anticorpo primario cattura e lavare i pozzetti con PBS (Phosphate Buffered Saline). Incubare le piastre con tampone bloccante per due ore a temperatura ambiente. Lavare i pozzetti nuovamente due volte con PBS e aggiungere le norme ai pozzetti aggiungere la soluzione di coniugato antigene nei pozzetti e incubare nuovamente per due ore. Lavare la piastra nuovo con PBS quattro volte. Aggiungere substrato e misurare la densità a vostra lunghezza d'onda di destinazione utilizzando un lettore ELISA.

Diretto (citocromo c) ELISA competitivo

Per una diretta ELISA competitivo un'analisi incrociate diluizione seriale deve essere eseguita per l'antigene che si sta utilizzando nell'esperimento. Il micro piastra poi è ricoperta di citocromo c e incubata durante la notte. La parte di ELISA dell'esperimento viene quindi eseguita aggiungendo reagente bloccante e anticorpo secondario. I risultati di assorbenza sono leggere con un lettore di micropiastre.

Incubare anticorpo primario in tubi

In questa procedura, l'anticorpo primario viene incubato in provette dove l'antigene di interesse si lega con l'anticorpo. I campioni vengono quindi aggiunti ai pozzetti di piastre micro titolo e incubati. I pozzetti vengono poi lavati per rimuovere eventuali complessi di associazione dell'anticorpo antigene non associato e quindi soluzione di blocco viene aggiunto per mantenere l'anticorpo secondario da associare ai pozzetti. L'anticorpo secondario è poi leggere su un lettore di piastre per ottenere i risultati.