Protocolli di analisi GSH

Glutatione o GSH è una proteina trovata in piante ed in animali. Si lavora per aiutare reazioni enzimatiche nella disintossicazione dei contaminanti ambientali. Inoltre, facilita il trasporto di aminoacidi all'interno delle cellule e aiuta a mantenere le reazioni di riduzione di proteina solfidrilici. Protocolli di analisi di GSH utilizzano GSH buffer, standard, substrato, enzimi e reagenti. Seguendo la procedura specifica è pertinente per l'esito del test.

Metodo enzimatico di riciclaggio

Il metodo enzimatico di riciclaggio, per GSH, utilizza glutatione reduttasi per quantificare il GSH. Questo protocollo è specificamente per plasma, tessuti o cellule in coltura i campioni. Aggiungere il reagente DTNB (acido 5-5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic) GSH. Il gruppo solfidrilico in GSH reagisce con il reagente e produce un giallo acido acido chiamato 5-thio-2-nitrobenzoico (TNB). Aggiungere l'acido e la miscela GSH a riciclare GSH e producono più acido glutatione reduttasi. In questa procedura, il tasso di produzione di acido è proporzionale alla reazione di riciclaggio di GSH; Pertanto, misurare l'assorbanza dell'acido TNB utilizzando uno spettrofotometro. L'assorbanza fornisce una stima dell'importo effettivo di GSH nel campione.

Analisi delle cellule del fegato di glutatione

Questo protocollo analizza la quantità di GSH in cellule umane dell'epatocarcinoma (cancro del fegato). Per eseguire questa procedura, è necessario utilizzare il metodo colorimetrico per la determinazione di GSH per ridurre e ossidare GSH. Ridurre GSH utilizzando 5-5'-ditiobis (acido 2-nitrobenzoico o DTNB) per formare il

prodotto colorato 2-nitro-5-thiobenzoic acido e glutatione ossidato (GSSG). Utilizzare glutatione reduttasi per ridurre nuovamente forma GSH GSSG. Al fine di misurare la quantità di GSH nelle cellule del fegato, leggere il campione a 415 assorbanza cineticamente su un lettore di micropiastre.

Apoptosi delle cellule

In questo protocollo, GSH viene utilizzato per rilevare l'apoptosi cellulare (morte) attraverso la misura del calo ridotto GSH. Una diminuzione della concentrazione di GSH cellulare è un indicatore della morte delle cellule. Il campione di cellule con thiolite non fluorescente macchia verde. Il verde di thiolite si accumula nel citoplasma (plasma delle cellule) e mitocondri (centrale elettrica) della cella. Utilizzare un citometro a flusso a 490/520 nanometri per visualizzare la quantità di GSH nelle cellule.

Concentrazione totale di GSH nei campioni di piante e animali

Misurare la concentrazione di GSH totale sia la forma riduttrice ed ossidata in diversi campioni animali e vegetali. Aggiungere il reagente del tiolo generale, 5-5'-ditiobis [acido 2-nitrobenzoico]. Il reagente di tiolo reagisce con GSH per formare 412 cromoforo nm, acido 5-thionitrobenzoic (TNB) e GS-TNB. Aggiungere glutatione reduttasi e Beta-nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) per ridurre il GS-TNB. Il glutatione inoltre rilascerà una seconda molecola TMB e riciclare il GSH. Inoltre, qualsiasi ossidato GSH (GSSG) presente nella miscela formata dalla reazione disolfuro è anche ridotto a GSH. Utilizzare un lettore di micropiastre a 405 nanometri per leggere il livello di capacità di assorbimento e indicano la concentrazione totale di GSH.