Gli svantaggi del Western Blotting

Gli svantaggi del Western Blotting

Macchiarsi occidentale è una delle procedure più comuni nei laboratori di biochimiche. In sostanza, esso separa le proteine da un campione di dimensione, quindi test utilizzando anticorpi per determinare se una data proteina è presente. È utile non solo nella ricerca ma anche nei laboratori medici o diagnostici; test per l'HIV e la malattia di Lyme, ad esempio, comportare una prova di analisi (ELISA) enzima-collegata dell'immunosorbente, seguita da un Western blot se ELISA test positivo. Nonostante la sua popolarità, tuttavia, Western blotting ha diversi svantaggi.

Nonquantitative

Classico Western blot sono nonquantitative. In altre parole, mentre dicono i ricercatori se è presente una particolare proteina, essi non rendono possibile quantificare quanto della proteina è presente. Alcuni biotech aziende ora vendere kit che permettono ai ricercatori o tecnici di laboratorio per quantificare la quantità di proteine presentano utilizzando uno standard curva..--ma questo funziona solo se i campioni puri della stessa proteina sono disponibili. Inoltre, il peso molecolare di una proteina può solo essere stimato con Western blotting, piuttosto che determinato precisamente come con spettrometria di massa.

Anticorpi

Un Western blot può essere eseguito solo se sono disponibili primari anticorpi contro la proteina di interesse. Mentre gli anticorpi per molte proteine diverse sono disponibili da aziende biotech, non sono a buon mercati; Se gli anticorpi primari non sono disponibili per una data proteina, non sarà possibile eseguire una macchia occidentale alla ricerca di quel particolare proteina. Inoltre, i ricercatori potrebbero essere necessario determinare se una proteina è stata modificata in qualche modo - se esso è stato fosforilato (aveva un gruppo fosfato collegato ad esso), per esempio - e con la tecnica del Western blot hanno bisogno di anticorpi specifici per la proteina modificata.

Formazione

Può essere difficile da eseguire correttamente un Western blot e ottenere buoni risultati, quindi il personale deve essere ben addestrato. In questo come in molto altro, l'esperienza è forse il miglior insegnante; anche per un tecnico esperto, tuttavia, un Western blot è molto tempo. La porzione di elettroforesi del gel dell'esperimento, ad esempio, in genere vi porterà da una a due ore per l'esecuzione. Altre attività possono essere eseguite mentre il gel è in esecuzione, naturalmente, ma l'esperimento prende ancora un po' di tempo per ottenere risultati.

Altre limitazioni

Gli anticorpi possono talvolta mostrare qualche associazione fuori bersaglio, che può fare per i più poveri risultati. Inoltre, con Western blotting, si utilizza un anticorpo contro una proteina specifica, quindi i risultati vi dirà solo se tale proteina era presente. Spettrometria di massa ad alta risoluzione, al contrario, rivela tutte le proteine presentano in un campione, e a differenza dei classici Western blotting esso è quantitativa. È importante ricordare, naturalmente, quella spettrometria di massa è molto più costosa e anche tecnicamente più impegnativo da utilizzare rispetto a macchiarsi occidentale.