Fini del buffer nell'elettroforesi

Fini del buffer nell'elettroforesi

Tecniche di elettroforesi separano le molecole di DNA in base al formato; tecniche simili per proteine possono separare le proteine in base alla dimensione o carica. In entrambi i casi il gel attraverso il quale eseguire la migrazione di queste molecole è preparato utilizzando una soluzione tamponata, dove un buffer è una sostanza chimica che agisce per stabilizzare il pH. Il buffer soddisfa diversi ruoli vitali nell'elettroforesi.

Corrente

Elettroforesi del gel funziona applicando una corrente elettrica per la lastra di gel di buffer-sommerso. Molecole di DNA sono caricati negativamente, e proteine possono essere fatta negativamente caricate da denaturare prima li e poi trattarli con sodio dodecil solfato (SDS). Le proteine caricate negativamente o molecole di DNA migrano lontano dal catodo negativamente e verso l'anodo positivamente caricato. Acqua, tuttavia, è un vettore molto povero di corrente-- solo trasporta corrente efficacemente quando esso ha dissolto sostanze in esso poiché ioni di carica si muovono in un campo elettrico. La soluzione tampone ha una maggiore concentrazione di ioni (più alta forza ionica), quindi può portare con sé molta più corrente rispetto all'acqua pura.

Cambiare pH

pH misura la concentrazione di ioni idrogeno. cambiamento di pH può alterare la carica netta di molecole come proteine o DNA, causando loro di migrare più lentamente (o più rapidamente). Ecco perché queste molecole hanno molti siti di base che possono accettare gli ioni di idrogeno (protoni) e molti siti acidi che possono donare protoni. Quando un acido dona un protone, diventa carica negativa; Quando una base accetta un protone, al contrario, esso diventa positivamente caricato. Come la concentrazione di ioni idrogeno della soluzione aumenta, proteine e DNA diventano meno caricato negativamente (o più positivamente). Il pH in cui una molecola come una proteina non ha nessuna carica netta viene chiamata suo punto isoelettrico. Buffer di stabilizzare il pH nel gel a un livello dove le molecole di DNA verrà addebitate negativamente ed eseguirà la migrazione come desiderato.

Gel d'impilamento

Buffer di svolgere un ruolo ancora più complesso in una sorta di elettroforesi SDS-PAGE di chiamato, o elettroforesi dodecilica del gel di poliacrilammide del solfato di sodio. SDS-PAGE è una delle tecniche più comuni per l'analisi delle proteine. Proteine sono denaturate dal trattamento termico, poi ricoperto con solfato dodecilico di sodio; Successivamente, vengono aggiunti ai pozzetti nel gel, che viene solitamente eseguito verticalmente. Il gel ha due regioni, il gel d'impilamento (in alto) e il gel in esecuzione sotto di esso. Il gel d'impilamento è preparato con un buffer diversi in modo che il suo pH è inferiore del gel in esecuzione; Inoltre, il buffer di impilamento ha una bassa forza ionica. Questi due fattori causano le proteine "impilare" o diventare inserita insieme che passano attraverso il gel d'impilamento affinché tutti entrare il gel in esecuzione allo stesso tempo. Questo effetto consente di assicurare che il gel in esecuzione separa le proteine unicamente in base al formato.

Buffer di elettroforesi su Gel del DNA

I due più comuni buffer per elettroforesi del gel del DNA sono EDTA tris-acetato ed EDTA tris-borato, dove l'acronimo acido etilendiamminotetracetico EDTA. EDTA è importante perché serve a chelato o "legare" gli ioni di magnesio, tenendo fuori di soluzione. Gli ioni magnesio sono cofattori essenziali per gli enzimi chiamati dnasi che spezzettare il DNA, così l'EDTA nel buffer serve come ulteriore precauzione per evitare eventuali problemi con dnasi.


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