Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) è un metodo di analisi chimica strumentale. Esso viene utilizzato per trovare la composizione chimica delle incognite. Il campione, disciolto in un solvente (fase mobile), viene pompato attraverso un tubo, o colonna, dotato di un solido poroso. La relativa affinità di sostanze chimiche nel campione verso l'imballaggio di colonna determinerà quanto tempo ci vuole i prodotti chimici per passare attraverso la colonna. Questo è noto come il tempo di ritenzione per un dato prodotto chimico. Tempi di ritenzione sono trovati sperimentalmente mediante l'esecuzione di un composto chimico noto attraverso la colonna in fase di test.
Istruzioni
Determinazione del tempo di ritenzione
• Decidere sulle condizioni che si utilizzerà per trovare il tempo di ritenzione della colonna in corso di valutazione. Le condizioni di base includerà il tipo di fase mobile solvente, solvente portata, tipo di rivelatore e impostazione ed il prodotto chimico specifico che verrà utilizzato. Queste Condizioni a volte possono essere trovate in un metodo di test ufficiale esistente.
• Collegare la colonna HPLC ad una pompa di fase mobile, all'ingresso del colonna e al rilevatore, all'uscita di colonna.
• Attivare i vari componenti di HPLC: il computer di acquisizione dati, rivelatore e pompa.
• Riempire il serbatoio di fase mobile con un solvente appropriato e avviare il flusso della fase mobile attraverso la colonna tramite la pompa.
• Preparare o ottenere una soluzione standard della sostanza chimica utilizzata per il test. Spesso tali standard di calibrazione possono essere acquistati già pronti. Si può anche fare una soluzione standard tramite la dissoluzione di un'adeguata quantità di prodotto chimico in solvente della fase mobile. A meno che non si sta seguendo un metodo specifico che ti dice diversamente, iniziare con una concentrazione standard di circa 50 parti per milione. Questo può essere aumentato o diminuito in modo da raggiungere un picco di uscita del rivelatore che è abbastanza piccolo per mantenere una forma simmetrica picco sia abbastanza grande per l'integrazione.
• Iniettare una quantità opportuna di soluzione standard su HPLC. Un volume di circa 10 microlitri è tipico. Allo stesso tempo, avviare acquisizione dati tramite computer.
• Seguire l'uscita rivelatore l'output di computer di acquisizione dei dati. Quando viene visualizzata la finestra di un picco sull'uscita, attendere due minuti e poi smettere di acquisizione dati.
• Utilizzando software di acquisizione dati, integrare l'output di rivelatore per identificare il picco di chimico. Dal software, leggere il tempo di mantenimento in cui si trova l'apice del picco.
Consigli & Avvertenze
- Tempi di ritenzione per un dato prodotto chimico e colonna possono cambiare a causa di fattori quali temperatura ambiente, fase mobile portata e invecchiamento di colonna. Tempi di ritenzione devono essere ricontrollati a intervalli regolari.
- Poiché HPLC software normalmente determina il tempo di ritenzione nel punto più alto dell'output di picco del rivelatore per una sostanza chimica, cambiamenti nella forma di picco (per esempio, a causa di sovraccarico colonna) possono dare cambiamenti apparenti in tempo di ritenzione.