Come utilizzare Western Blot

Come utilizzare Western Blot

Macchiarsi occidentale è una tecnica di laboratorio per la rilevazione l'abbondanza di proteine di interesse. È un metodo preciso, più spesso utilizzata per confrontare i livelli di proteina dei due campioni, uno trattati in un certo modo e non trattati e utilizzati come controllo. La rilevazione delle proteine è basata sul loro grippaggio agli anticorpi specifici e pertanto è efficace per garantire il rilevamento di solo vostra proteina di interesse.

Istruzioni

Protocollo occidentale della macchia

• Campioni di separata della proteina di peso molecolare tramite l'elettroforesi del gel. Elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) è più comunemente usato.

• Immergere macchia documenti e membrane di nitrocellulosa in metanolo per poi passare al buffer di trasferimento.

• Proteine di trasferimento dal gel di una membrana di nitrocellulosa assemblando un panino di una macchia carta, una membrana di nitrocellulosa, il gel e l'altra macchia carta nella cella trasferimento e girare la cella di trasferimento verso la tensione suggerita. Le proteine saranno trasferite dal gel alla membrana nello stesso modello di separazione.

• Buttare via le carte della macchia e gel. Incubare la membrana con il 5 per cento latte per associare appiccicosi aree la nitrocellulosa che potrebbero interferire con il rilevamento della vostra proteina. Incubare per un minimo di un'ora. Latte di solito viene sciolto in 1 X Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), ma possono variare a seconda il protocollo.

• Versare il latte e incubare la membrana durante la notte a 4 gradi Celsius con un anticorpo primario scelto da associare alla vostra proteina di interesse. Controllare la scheda di informazioni di prodotto per quale soluzione sciogliere il vostro anticorpo in (di solito latte) e in quale concentrazione.

• Lavare la membrana con tampone di lavaggio almeno 5 volte per 5 minuti ogni volta. In tal modo che qualsiasi anticorpo primario non legato viene lavato via la membrana per non interferire con le letture. 1 X TBST è un tampone di lavaggio comunemente utilizzati.

• Incubare la membrana un'ora a temperatura ambiente con un anticorpo secondario che riconoscerà il vostro anticorpo primario. Gli anticorpi secondari sono identificati da quale specie interagiscono con, ad esempio anti-mouse o anti-coniglio. Scegliere l'anticorpo secondario che corrisponde la specie di origine del vostro anticorpo primario. Garantire che l'anticorpo secondario è coniugato a un enzima della perossidasi del rafano e verificare con il produttore per condizioni e concentrazioni di dissoluzione.

• Lavare la membrana con tampone di lavaggio nello stesso modo come sopra per garantire la rimozione di qualsiasi anticorpo secondario non associato. Questo aiuta a prevenire livelli di rumore di fondo.

• Incubare la membrana con un reagente di chemiluminescenza (ECL) per 5 minuti a temperatura ambiente. Kit ECL sono dotate di due componenti, un componente di luminol e un componente di perossidasi. Questi due sono mescolati insieme prima dell'aggiunta alla vostra membrana. La perossidasi del rafano il vostro anticorpo secondario associato verranno fendere il luminol dall'ECL causando la membrana per emettere luce ovunque l'anticorpo secondario è associato.

• Sigillare la membrana in un foglio di plastica coperchio e un nastro in una cassetta della pellicola per lo sviluppo.

• Esporre la membrana di un film in una stanza buia e passarla allo sviluppatore di visualizzare il segnale da vostra proteina. È importante ottenere bande scure abbastanza per vedere la proteina, ma non è così buio che sono indistinguibili. Variare i tempi di esposizione per ottenere un segnale chiaro.

• Calcolare l'abbondanza relativa dei vostri campioni di proteine utilizzando un programma per misurare la densitometria o l'oscurità di ciascuna banda.

Risoluzione dei problemi di Western Blot

• Rotolare il vostro panino della macchia-membrana-gel-macchia con una pipetta di vetro prima di iniziare il trasferimento. Ciò per eliminare eventuali bolle d'aria che interferiscono con il trasferimento di quantità adeguata di proteine.

• Variando la concentrazione di vostro anticorpo primario se si ottiene un segnale debole che non può essere rilevato dopo tempi di esposizione lunghi. Una maggiore concentrazione di anticorpo primario promuoverà più vincolante alla vostra proteina.

• Variare la concentrazione del vostro anticorpo secondario se c'è un alto livello di rumore di fondo sulla vostra macchia. Una minore concentrazione di anticorpo secondario può contribuire a ridurre il legame non specifico.

• Lavare la membrana più a lungo per aiutare nell'eliminazione del rumore di fondo.

• Blocco con latte per più di 1 ora se sviluppato film contengono un sacco di rumore di fondo. Inoltre, la normale del siero dell'animale ospite anticorpo secondario può essere utilizzato per il blocco.

Consigli & Avvertenze

  • Leggere sempre le etichette di tutti i reagenti utilizzati ed uso e smaltirle secondo le specifiche. Indossare sempre dispositivi di protezione individuale come guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione quando si lavora in laboratorio.