Glutatione o GSH, è un tripeptide non essenziali effettuato in cisteina, glutammato e glicina. È un potente antiossidante che protegge le cellule e gli organi del vostro corpo dagli effetti nocivi di ROS, o specie reattive dell'ossigeno, che sono formate da ossigeno molecolare come risultato di vari processi metabolici nel corpo. Antiossidanti, come glutatione, neutralizzano i ROS e impediscono loro di interagire con e danneggiare il DNA e la proteina nelle vostre cellule. Il rapporto di forma ossidata e ridotta di GSH nel vostro corpo è indicativo dello stress ossidativo ROS-relative nel vostro corpo.
Istruzioni
• Disegnare circa 2 ml di sangue mediante prelievo venoso alla vena anticubetal con un ago a farfalla 23 gauge collegato a una siringa da 5 ml. Aggiungere il campione per provette contenenti eparina sodica e capovolgere delicatamente la provetta per la miscelazione.
• Raccogliere i globuli rossi mediante centrifugazione del campione a 2.500 giri al minuto per cinque minuti. Congelare e scongelare il campione tre volte per rompere le cellule. Centrifugare la soluzione di lisato cellulare a 12.000 giri/min e 4 gradi per 10 minuti e raccogliere il surnatante.
• Rimuovere la proteina dall'esempio aggiungendo acido solfosalicilico 5 per cento e centrifugazione del campione a 12.000 giri/min per cinque minuti a 4 gradi. Conservare il surnatante a-112 gradi deproteinato.
• Mescolare un agente di rilevamento del tiolo, GSH reduttasi, nicotinammide adenina dinucleotide fosfato e dosaggio buffer nelle proporzioni indicate dal produttore del kit per rendere la miscela di reazione di GSH. La quantità di ciascuna sostanza chimica dipende dal numero di test che si intende eseguire. Diluire la miscela di reazione di GSH in acido solfosalicilico 5 per cento per ottenere concentrazioni di 16, 32, 63, 125, 250 e 500 microlitri.
• Aggiungere da 1 a 10 microlitri di campione di sangue di deproteinato nei pozzetti di una micropiastra. Aggiungere in serie diluito soluzione standard di GSH, che è disponibile nel kit di prova, a ciascun pozzetto per portare il volume totale di ciascun pozzetto a 10 microlitri.
• Aggiungere 90 microlitri di miscela di reazione di GSH apportate nel passaggio 4 per ogni pozzetto in micropiastra. Mescolare il reagente agitando la piastra per 30 secondi.
• Misurare l'assorbanza immediatamente inserendo la piastra sotto la luce con lunghezze d'onda di 405 e 415 nanometri. Incubare la piastra per 30 minuti. Prendere le letture di assorbanza dopo ogni cinque minuti durante l'incubazione.
• Diluire 6 millimolar del campione trattato con soluzione di solfosalicilico acido e trifluromethane di solfonato di 5 per cento. Questo rimuoverà tutti i GSH ridotto dalla soluzione. Aggiungere da 1 a 10 micoliters di questa soluzione ai pozzetti di micropiastre e ripetere i passaggi 5, 6 e 7. Questo vi aiuterà a stimare la quantità di GSH ossidato nel campione.
• Tracciare le concentrazioni di assorbanza e campione su un grafico per ottenere la curva di GSH glutatione sia ridotto e ossidato. Calcolare il rapporto tra entrambe le forme di GSH. I livelli aumentati livelli di GSH ossidativi indicano lo sforzo ossidativo e ROS.
Consigli & Avvertenze
- Seguire attentamente tutte le istruzioni contenute nel kit del produttore e il manuale tecnico.
- Prendere le necessarie precauzioni come guanti e occhiali durante l'utilizzo di campioni biologici.
- Assicurarsi che le letture sono accurate. Piccole variazioni nella lettura di assorbanza di GSH possono alterare i risultati del test.