Cromatografia liquida ad alte prestazioni è un metodo per separare una miscela di composti al fine di purificare, identificare e quantificare ogni componente. HPLC utilizza una pompa per passare una miscela di interesse nel corso di una fase solida in una colonna e misura il tempo necessario per i composti di passare sopra la fase solida. Tempo di conservazione varia a seconda della forza di interazione tra la fase solida e la mescola di interesse, la composizione del solvente utilizzato e il tasso di flusso controllato dalla pompa. Composti sono visualizzati con un picco corrispondente ad una capacità di assorbimento UV/visibile a una lunghezza d'onda specificata.
Istruzioni
Passaggi per la risoluzione di un HPLC
• Sostituire il vecchio filtro e fritta svitando le loro rispettive copertine, buttare via il vecchio filtro o fritta, e l'aggiunta di uno nuovo. Avvitare i coperchi torna bene. Questo eliminerà intasamento nelle linee.
•
Serrare i dadi prima e dopo la colonna utilizzando una chiave di entità adeguata.
•
Utilizzare il tubo più corto possibile con il diametro più piccolo possibile per collegare la colonna con il resto del sistema. Questo eliminerà il volume di colonna supplementare che può interferire con il rilevamento di composto.
• Lavare la colonna con almeno 3 volumi di colonna di un forte solvente prima di aggiungere composti. Ciò elimina la contaminazione e bolle d'aria.
• Monitorare come molte lunghezze d'onda come possibile con il sistema HPLC. Scegliere la lunghezza d'onda che fornisce il più evidente picco corrispondente al vostro composto. Un picco singolo, in posizione verticale, a punta dovrebbe essere osservato. Ampio, split, o tailing cime sono un segno che è necessaria la risoluzione dei problemi.
• Sciogliere il composto di interesse in vari solventi e iniettare loro sulla colonna. Se picchi sono larghe, Spalato, o la coda alla fine, provare un diverso sistema di solvente.
• Prova iniezione differenti dimensioni specificando microliter importi nel programma software per garantire il sovraccarico della colonna non è responsabile di tailing, vasto o picchi di Spalato.
• Testare diversi sistemi solvente per la fase mobile. Possono essere utilizzate diverse percentuali di acqua e solventi organici. Monitor picco dimensioni e forme per trovare il sistema ottimo di solvente.
• Testare la portata per i composti viene passato sopra la colonna specificando diverse tariffe e monitoraggio pressione colonna e dimensioni massime e forma.
• Se colonna pressione è troppo alta, rimuovere la colonna e il gancio della tubazione insieme. Eseguire il sistema solvente attraverso la pressione della tubazione e monitor. Se il sistema ha ad alta pressione senza una colonna presente, controllare nuovamente il filtro, fritta e linee. Se la pressione è bassa con nessuna colonna presente, ricollegare la colonna e lavare con un forte solvente per eliminare eventuali blocchi.
Consigli & Avvertenze
- Indossare sempre dispositivi di protezione quando si lavora in un laboratorio. Questo include un camice da laboratorio, occhiali e guanti.