Western blot è una tecnica usata in biochimica per rilevare i tipi di proteine in un campione. Le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e trasferito ad una membrana, dove esso è sondato con gli anticorpi. Gli anticorpi allegare alle proteine sulla membrana. Una sostanza chimica fluorescente viene quindi aggiunto alla membrana, che reagisce con gli anticorpi, tale che le proteine sono visibili dopo l'esposizione alla pellicola.
Istruzioni
• Lavarsi le mani e indossare guanti di lattice o nitrile.
• Rimuovere il tessuto cellulare dalla camera di incubazione. Posto circa 1 grammo del tessuto in un mortaio. Aggiungi nel mortaio per coprire il tessuto abbastanza azoto liquido. Macinare il tessuto congelato con il pestello fino a quando si tratta di una polvere.
• Aggiungere la polvere in una provetta. Aggiungere 10 ml di tampone di lisi alla provetta. Uso un polytron in 20 secondi scoppia fino alla polvere e liquido sono omogenei.
• Tappare la provetta e posizionarlo in una centrifuga. Eseguire la centrifuga a una forza centrifuga 500 a 4 gradi Celsius per 15 minuti. Rimuovere il liquido nella parte superiore del tubo con una pipetta e scartare.
• Aggiungere 5 ml di tampone di lisi per il pellet in provetta per 20 secondi. Centrifugare la provetta nuovamente per lo stesso tempo e alla stessa temperatura e forza As in passaggio 4. Rimuovere il liquido nella parte superiore della provetta. Aggiungere 5 millilitri più buffer di lisi e ripetere la fase di centrifuga.
• Aggiungere tampone di risospensione sufficiente alla provetta per coprire il pellet. Agitare la provetta delicatamente per mescolare il buffer e pellet. Versare il liquido in una provetta eppendorf e congelare i campioni a negativo 80 gradi Celsius.
Consigli & Avvertenze
- Evitare cicli ripetuti di disgelo-congelamento dei vostri campioni, che possa danneggiare le proteine.