Il profilo genetico di una cellula è codificato all'interno del suo materiale genetico o DNA. Come il DNA non lascia mai il nucleo della cellula, in ordine per questo informazioni entrare nel citoplasma dove altre proteine e componenti biochimici risiedono, è necessario trascrivere prima il DNA in RNA messaggero (mRNA o poli RNA). Questo mRNA diventa poi tradotto in proteine che svolgono numerose funzioni della cellula. Per rilevare o quantificare mRNAs molto raro, fare sonde per i microarrays o costruire librerie di molecole complementari di DNA, mRNA deve essere isolato. Tuttavia, totale estrazione del RNA (cioè tutto il RNA in una cella) e conseguente isolamento di mRNA non sono mutualmente esclusivi processi; il primo deve essere eseguito in ordine per mRNA da estrarre.
Istruzioni
Isolamento di mRNA da RNA totale
• TRIzol omogeneizzazione: RNA totale comprende tutti gli mRNA, RNA transfer, RNA ribosomiale e altri RNA non codificanti. Per separare questi da altri componenti cellulari, la cellula è in primo luogo scoppiare aperto per rilasciare il contenuto. Questo viene fatto da risospendere le cellule pellettate di centrifugazione (filatura ad alta velocità) in TRIzol Reagent (tecnologie di vita). Altre versioni di TRIzol (ad esempio TRI reagente di Ambion) funzionano allo stesso modo.
• Isolamento di RNA totale: Una serie di centrifugazioni è utilizzata per separare i diversi componenti (proteine, DNA, RNA) della cella in strati, o fasi, all'interno della sospensione. La parte superiore, colore giallo fase è composto da grasso e può essere scartato. La fase desiderata è colorato in rosso, contiene il RNA totale e viene mantenuta. Dopo l'esecuzione di un'estrazione del fenolo-cloroformio e una serie di lavaggi di alcol utilizzando isopropanolo ed etanolo, il RNA può essere pellettato per isolamento di mRNA. Aggiungere gli inibitori RNasi per impedire che questo enzima degradare il RNA totale.
• mRNA estrazione: è comune utilizzare un kit per isolare i mRNAs, come protocolli di laboratorio casalingo non generano grandi quantità di mRNA altamente purificato. Kit commerciali includono FastTrack 2.0 di Invitrogen o Poly (A) mRNA puro di Ambion Kit di isolamento. Procedura di base è comune a tali Kit:
a) mescolare il buffer di Lisi ha inibito la RNasi fornito nel kit con fino a 300 microlitri di RNA totale.
b) riscaldare per 5 minuti a 65 gradi Celsius e quindi immediatamente raffreddare il campione sul ghiaccio per un minuto.
c) mescolare con cloruro di sodio 0,5 M e poi sciogliere completamente Oligo dT (acido oligodeoxythymidylic) in questo esempio.
d) Centrifugare questo campione e recuperare il surnatante, che è lavato più volte in una serie di vincolante e basso sale buffer fornito nel kit.
e) eluire mRNA diverse volte fino ad ottenuta un volume di kit-specificato (ad esempio 500 microlitri).
f) precipitare l'eluito dalla precipitazione di sodio acetato ed etanolo. Risospendere in fino a 20 microlitri di dietilpirocarbonato (DEPC)-acqua trattata.
g) conservare a-80 gradi Celsius e verifica per qualità e quantità mediante spettrofotometria.
Consigli & Avvertenze
- Conservare tutti i reagenti, cellule e RNA freddo immergendo nel ghiaccio. Ciò impedisce che il RNA viene degradato da qualsiasi altri enzimi che diventano rilasciati durante il processo di omogeneizzazione.
- Reagenti come TRIzol sono tossici e non devono essere a contatto con la pelle o le mucose. Osservare sempre i protocolli del laboratorio sicuro maneggiare questo reagente.