Gel filtrazione colonne vengono utilizzate per separare le proteine da miscele complesse. Poiché ogni proteina ha un peso molecolare unico, possono essere indotti a separare in strati distinti eseguendo la migrazione attraverso una colonna di filtrazione contenente una matrice di gel uniformemente distribuita. Per identificare correttamente ogni proteina che è separato fuori, sarà necessario calibrare le colonne utilizzando diverse proteine di peso molecolare noto.
Istruzioni
• Rimuovere le fiale di anidrasi carbonica, citocromo C e aprotinina dal frigorifero o congelatore e consentire loro di raggiungere la temperatura ambiente. Aggiungere 4 mg di ogni proteina in una provetta per centrifuga per millilitro di gel nella colonna di filtrazione. Aggiungere 961 mcl di basale sale per milligrammo di proteina per ogni provetta da centrifuga per dissolvere le proteine. Aggiungere 39,2 mcl di ferritina per millilitro di gel in ogni provetta e poi mescolare in una centrifuga.
• Spegnere la pompa di filtrazione della colonna e chiudere il rubinetto all'ingresso colonna. Svitare, ma non rimuovere, la parte superiore della colonna di filtrazione. Impostare la pompa alla massima portata per la colonna e riavviare la pompa fino a quando è stato attinto il materiale tampone. Fermare la pompa.
• Aggiungere 1 ml di ciascuna proteina nella colonna di filtrazione utilizzando una pompa di dispensare. Sgocciolare le proteine all'interno della colonna da un'altezza di 1 cm a 2 cm, lavorando intorno al bordo interno della colonna. Lasciare che la miscela di proteine a stabilirsi in cima la matrice di gel.
• Posizionare il tubo di uscita della pompa in un cilindro pulito e asciutto graduata da ml 250. Riavviare la pompa ad un tasso di 0,30 ml al minuto ed eseguire le proteine nella matrice del gel. Mentre la pompa sta funzionando, sciacquare le pareti del tubo utilizzando la pompa di dispensare e una piccola quantità di liquido tampone. Una volta che le proteine sono pienamente entrati matrice del gel, ridurre la velocità della pompa a 0,02 ml al minuto e pompa in un 5cm allo strato di 7 cm di liquido tampone in cima la matrice.
• Scollegare il cappuccio della colonna dal rubinetto. Pulire il tappo di colonna e all'interno della colonna utilizzando scientifica salviette per la pulizia. Reinstallare il tappo di colonna. Riempire il serbatoio tampone con tampone liquido. Collegare una siringa al rubinetto e aprirlo. Utilizzare la siringa per disegnare una piccola quantità di tampone attraverso il tubo e nella siringa. Chiudere il rubinetto e collegarlo alla parte superiore della colonna. Aprire il rubinetto e verificare eventuali perdite.
• Eseguire la colonna a 0,02 ml al minuto per diversi giorni, fino a quando la band di ferritina si avvicina alla fine della colonna. Raccogliere tutto il gel filtrazione che viene pompato fuori nel cilindro graduato.