Primer, noto anche come "oligos", sono filamenti corti di nucleotidi chiamati oligonucleotidi che vengono utilizzati come sequenze di innesco in reazioni a catena della polimerasi (PCR). I primers "base-accoppiamenti" fino agli estremi confini della sequenza da copiare, fornendo allegato 3'-fine siti per nucleotidi in arrivo. Un'ottima temperatura di ricottura è basata sulla composizione dei primer e consente specifica appaiamento dei oligos alla sequenza di interesse. Diversi metodi possono essere utilizzati per calcolare ottima temperatura di ricottura, o Ta.
Istruzioni
Per primer meno di 14 basi di lunghezza
• Aggiungere il numero di guanine e cytosines nella vostra sequenza di primer e poi sommare il numero di adenine e thymines.
• Moltiplicare il totale guanine plus cytosines per quattro e moltiplicare il totale adenine plus thymines per due.
• Sommare i due totali per fusione (Tm) la temperatura di vostri iniettori e quindi sottrarre cinque per Ta ottima. Così, Ta = [4(GC) + 2(AT)] -5.
Per primer maggiore di 14 basi di lunghezza
• Trovare il numero totale di guanine plus cytosines in vostro iniettore.
• Inserire il totale guanine plus cytosines nella formula fornita da Promega: "Tm = 64,9 gradi C + 41 gradi C x (numero di G e di C nell'iniettore - 16,4) /N, dove N è la lunghezza del primer."
• Sottrarre cinque da questo totale per Ta. Così, Ta = [64,9 gradi C + 41 gradi C (Totale 16,4 G + C) /N] - 5.
• Invece di utilizzare la più semplice formula: Ta = 3 (Totale guanine più cytosines) + 2 (Totale adenine più thymines).