Come calcolare Kcat

Come calcolare Kcat

Nelle reazioni chimiche catalizzate da un enzima, l'enzima riduce la quantità di energia di attivazione necessaria temporaneamente di legame con il substrato e ruotandolo in uno stato sforzato. Il k(catalyst) o "kcat" per la reazione si riferisce alla costante indipendente dalla concentrazione per il tasso al quale un particolare enzima può metabolizzare un substrato in una molecola di prodotto. Per calcolare kcat, scienziati prima mescolano diverse provette con concentrazioni variabili di substrato (noto come un "dosaggio") e li prova a intervalli di tempo costanti con un luce spettrofotometro per misurare le concentrazioni crescenti di molecole dei prodotti. Questi dati vengono quindi tracciati su un grafico e analizzati.

Istruzioni

Calcolo velocità iniziali

• Tracciare un grafico della concentrazione del prodotto rispetto al tempo per i dati da provetta prima del dosaggio enzimatico. Nota: l'asse orizzontale dovrebbe essere "tempo", e l'asse verticale dovrebbe essere "concentrazione del prodotto."

• Calcolare la retta di regressione lineare per i punti dati che è tracciata nella sezione 1, punto 1. Mentre Excel e calcolatrici grafiche possono determinare facilmente questo modello lineare, è possibile derivare una stima della pendenza della retta di regressione dividendo la differenza nella concentrazione di prodotto tra i punti di dati adiacenti dalla loro differenza nel tempo.

• Registrare la pendenza della retta di regressione lineare dalla sezione 1, punto 2 come "velocità di reazione iniziale (Vo)." Nota: nel modello di linea di regressione "[concentrazione del prodotto] = m [tempo] + b," il coefficiente "m" è la pendenza.

• Ripetere i passaggi 1, 2 e 3 per il resto delle provette nel dosaggio.

Calcolo di Vmax

• Tracciare l'inversa di concentrazione del substrato per ogni provetta contro l'inverso della sua velocità di reazione iniziale (dalla sezione 1, punto 4). Ad esempio, se la velocità iniziale per una provetta con una concentrazione di substrato iniziale di 50 micromolar (ehm) era 80 uM/s, gli inversi sarebbero stato 1/50 uM per la concentrazione di substrato e 1/80 uM/s per la velocità iniziale. Nota: la concentrazione di substrato inversa deve essere sull'asse orizzontale, e la velocità iniziale inversa deve essere sull'asse verticale.

Nota: la concentrazione del substrato deve essere sull'asse orizzontale e velocità di reazione iniziale dovrebbe essere sull'asse verticale.

• Determinare la retta di regressione lineare per il grafico che è tracciata nella sezione 2, punto 1. Nota: poiché sarà necessario conoscere la y-si intersecano per la retta di regressione, si dovrebbe immettere i punti dalla sezione 2, passaggio 1 in Excel o una calcolatrice grafica e utilizzare la regressione built-in funzionalità di modellazione.

• Dividere 1 del y-intersezione della linea di regressione lineare. Questo vi darà il valore dell'inverso di Vmax, la velocità massima di reazione per l'enzima. Nota: se il modello di regressione lineare assume la forma "[Inverse Vo] = m [Inverse substrato conc.] + b,"allora il valore di"b"sarebbe il y-intersect. Dividere 1 per "b" per calcolare l'inverso di Vmax.

• Dividere 1 per il risultato dalla sezione 2, passo 3 per calcolare il valore effettivo di Vmax.

• Determinare la concentrazione dell'enzima nel dosaggio originale (Vedi i dati grezzi). Nota: la concentrazione di enzima è lo stesso per tutti i tubi di prova; solo le concentrazioni di substrato variano nel dosaggio.

• Dividere il Vmax (dalla sezione 2, punto 4) per la concentrazione di enzima (dalla sezione 2, punto 5). Il risultato è il valore di Kcat.