Nell'elettroforesi del gel, campioni di DNA o proteine sono separati..--in genere basato su dimensioni-- applicando un campo elettrico che li induce a migrare attraverso un gel. L'uso di elettroforesi del gel è di routine nei laboratori di ricerca biomedica e viene utilizzato per rispondere a una varietà di questioni diverse, quindi non c'è davvero un modo universale per analizzare i risultati. Tecniche differenti come Western blotting, Northern blotting e Southern blotting, ad esempio, tutti implicano elettroforesi del gel. Se stai facendo l'elettroforesi del gel dell'agarosi di campioni di DNA, il più comune tipo di procedura, in genere sarà necessario fare almeno due cose: 1) distinguere uncut plasmidi da inserti, intaccati plasmidi e tagliati plasmidi e 2) stimare le dimensioni di vari frammenti di DNA. Ecco come funziona.
Istruzioni
• Controllare il vostro notebook di laboratorio per determinare che i campioni sono stati caricati in quali corsie. Quando caricato i pozzetti per il gel, dovrebbe avete notato l'identità di ogni corsia/campione.
• Determinare quale corsia contiene la "scala" di campioni di DNA. Questi sono frammenti di lunghezza nota; loro distanza di migrazione può essere utilizzato per determinare la dimensione dei frammenti del campione.
• Utilizzando un righello, misurare la distanza sulla tua immagine dai pozzi per la tintura di rilevamento, che vi hanno viaggiato oltre qualsiasi delle bande di DNA (in altre parole, sarà nella parte inferiore del gel). Registrare questo numero..--le unità che si utilizza non sono importanti.
• Misurare la distanza sulla tua immagine dai pozzetti per ciascuna delle bande nella "scala", poi dividere quella distanza dalla distanza percorsa dal tracking banda di tintura. Questo calcolo ti dà la mobilità relativa di ciascuna banda.
Esempio: Supponiamo che il tracciamento banda tintura viaggiato 6 pollici e abbiamo tre bande che ha viaggiato 5, 3,5 e 4,5 pollici. Qual è la loro mobilità relativa?
Risposta: Dividiamo 5, 4.5 e 3.5 da 6 per ottenere la relativa mobilità di 0,833, 0.75 e 0.5833.
• Immettere la relativa mobilità nel tuo programma di foglio di calcolo (Excel o qualsiasi altro programma simile che si utilizza) insieme con la dimensione in kilobasi di ogni frammento nella scala. (Il produttore ti dà la dimensione di ogni frammento nelle scale che forniscono, quindi si dovrebbero già avere queste informazioni.)
• I dati del grafico con relativa mobilità su x e dimensione in kilobasi sul y.
• Utilizzare la funzione di linea di tendenza sul vostro programma di foglio di calcolo per adattarsi a un'equazione ai dati. Questa equazione dovrebbe essere un'equazione di potenza (per esempio x ^ -2) e dovrebbe andare bene i dati relativamente bene (R-coefficiente di almeno 0,9).
• Guardate le bande corrispondenti ai vostri campioni. Ricordate che DNA più piccolo frammenti di viaggio più lontano attraverso il gel più grandi frammenti di DNA, così quelli più vicini alla tintura di rilevamento sarà il più piccolo. Si noti, tuttavia, che se il DNA del plasmide (circolare) è uncut, diventerà "supercoiled" o ritorto come un cavo telefonico, che in realtà causerà di viaggiare più lontano di DNA lineare delle stesse dimensioni. Allo stesso modo, un plasmide "intaccato" che è stato tagliato in modo incompleto si recherà una distanza inferiore a DNA lineare delle stesse dimensioni. Di conseguenza, si non possono stimare le dimensioni di plasmidi uncut dal vostro gel.
• Abbinare le bande in ogni corsia con l'identità del campione che è stato caricato in quel vicolo e determinare se quello che vedi è quello che si sarebbe aspettato. Questo dipenderà la natura del tuo esperimento. In generale, tuttavia, se digerito un plasmide inserto con due enzimi di restrizione, che ci si aspetta che l'inserto sarebbe stato liberato dal plasmide; dato che è molto più piccolo del plasmide, che ci si aspetta di vedere due bande in quanto Vicolo, uno vicino alla parte superiore e l'altro verso il basso nella parte inferiore. Un plasmide tagliato con un solo enzima di restrizione dovrebbe forma una sola band che viaggia un po' più lontano di quanto il plasmide tagliato con due enzimi di limitazione, ma in nessun posto vicino per quanto riguarda l'inserto.
• Misurare la distanza dai pozzi per il plasmide tagliato e inserire bande con il righello. Dividere questi numeri per la distanza percorsa dal colorante rilevamento per trovare mobilità relativa degli inserti e tagliare i plasmidi.
• Collegare la mobilità relativa degli inserti e tagliare plasmidi nell'equazione calcolato il tuo foglio di calcolo per voi. Questo calcolo dovrebbe darvi una stima delle dimensioni di questi plasmidi.
Consigli & Avvertenze
- Se vedi bande luminose, ampie nella parte inferiore di ogni singola corsia, probabilmente avete alcuni RNA nel vostro gel..--il protocollo di purificazione può essere imperfetto.