Tipi di cromatografia per la preparazione dell'antigene

Un antigene è una molecola riconosciuta e vincolato da un anticorpo. Se stai cercando di preparare l'antigene per un esperimento, a seconda di come si produce l'antigene e il protocollo, ci sono diversi tipi di tecniche cromatografiche si potrebbe usare. Cromatografia di immunoaffinità è il più potente di questi ma anche il più costoso. Cromatografia di esclusione dimensionale, nichel-istidina cromatografia e cromatografia a scambio ionico sono possibilità, pure.

Cromatografia di immunoaffinity

Questa tecnica utilizza dell'agarosi branelli trattati per attaccare gli anticorpi a loro; gli anticorpi sono specifici per l'antigene di interesse. Una volta che le perle sono state preparate, potrai versare i residui contenenti le perline nella colonna e versare buffer tramite per lavare qualsiasi restante conservante o di sali; Questo passaggio è denominato equilibrare la colonna. Infine, si aggiungerà il campione contenente l'antigene. Solo l'antigene si lega agli anticorpi; gli altri componenti della miscela saranno fluire attraverso la colonna e venire fuori l'altra estremità o eluire, quando si aggiungono più buffer. Questo approccio è molto potente ma anche molto costoso, perché gli anticorpi sono costosi da produrre.

Nichel-istidina cromatografia

Se si sta producendo un antigene trasformando Escherichia coli con il gene per la proteina, si potrebbe etichettare la proteina con un tag 6-istidina per purificazione più facile. Questo "tag" è solo una serie di sei aminoacidi consecutivi tacked sopra un'estremità della proteina. Insieme questi istidine hanno un'affinità molto alta per gli ioni metallici come nichel e cobalto, così l'antigene può essere purificato usando i branelli che hanno acido nitriloacetic ad essi connessi. NTA lega gli ioni nichel e i tag 6-istidina a sua volta legano il nichel. Preparazione della colonna è simile a cromatografia di immunoaffinità.

Cromatografia di esclusione dimensionale

SEC utilizza molto più colonne rispetto alle procedure di cromatografia di affinità, e queste colonne devono essere preparate in anticipo, poiché le perle hanno bisogno di tempo per stabilirsi. Le perle in un esperimento di SEC sono effettivamente Sephadex perline che avevano i buchi, un po' come piccole spugne. Piccole proteine possono utilizzare loro modo in questi fori, mentre grandi proteine non possono, così quando il campione viene versato attraverso la colonna, le proteine più grandi saranno eluire prima di quelle piccole. È possibile seguire l'avanzamento delle proteine attraverso la colonna utilizzando coloranti di rilevamento, che si comporteranno in modo simile.

Cromatografia a scambio ionico

Come il pH di una soluzione diventa più di base, alcuni amminoacidi in una proteina diventano deprotonato o perdere ioni di idrogeno, quindi loro carica netta diventa meno positivo (o negativa). A alcuni pH specifico, la proteina non avrà nessuna carica netta; in altre parole, sarà neutra, né positivamente né negativamente caricata. Questo pH è chiamato il punto isoelettrico, e varia per diverse proteine. Cromatografia a scambio ionico si avvale di queste differenze per aiutare a purificare l'antigene. Il campione viene introdotto in una colonna con tampone a pH specifico e le perle nella colonna contengono siti che interagiscono con gli ioni positivamente caricati (o a volte siti che interagiscono negativamente con ioni caricati invece). Proteine ed antigeni con maggiori oneri avrà più tempo per farsi strada attraverso la colonna, che rende possibile per separarli.


POTREBBE PIACERTI ANCHE