Regole per il disegno di Primer

Regole per il disegno di Primer

Dalla sua scoperta da Kary Mullis nel 1983, la PCR (reazione a catena della polimerasi) è diventata una procedura standard eseguita nei laboratori di tutto il mondo. PCR può amplificare un singolo filamento di DNA in miliardi di fili in poche ore. La reazione richiede modello DNA, deossinucleotidi (dNTP), DNA polimerasi e due iniettori---uno per duplicare il DNA in direzione di 'senso' e uno per duplicare il DNA in direzione anti-senso. Per risultati ottimali, queste linee guida dovrebbero essere utilizzate in combinazione con primer progettazione del software.

PCR

DNA esiste come due catene elicoidali, costituito da una dorsale di zucchero e fosfato e deossinucleotidi: adenina (A), tiamina (T), citosina (C) e guanina (G). I due filamenti di DNA sono complementari uno a altro. Vale a dire la A su un capo si abbina con una T sull'altro filamento; C e G coppia allo stesso modo. 5' a 3' direzione dei fili è anche complementare. A causa di questo complemento, replicazione del DNA avviene in maniera semi-conservativa.

Nella PCR, questo consiste nell'aumentare la temperatura tale che la doppia elica del DNA si sfascia o denatura, nei singoli fili. Con relativamente grande, ingombranti filamento complementare di mezzo, una breve sequenza complementare può temprare. Questa breve sequenza è un primer.

Una volta temprato, DNA polimerasi può iniziare ad aggiungere monomeri nucleotidi (dNTP) all'estremità 3' del primer. Questa è la fase di 'estensione'. Dopo l'estensione, il DNA è denaturato e il ciclo ricomincia.

DNA bersaglio

Il primo passo nella progettazione degli iniettori è identificare una sequenza appropriata nel gene di interesse (GOI) per l'amplificazione. Questa è detta la 'destinazione'. È importante che la sequenza di DNA per la destinazione è assolutamente unica rispetto al resto del codice genetico dell'organismo. Idealmente, la sequenza di destinazione sarà ovunque da 100 a 500 paia di basi, a seconda del tipo di analisi che il ricercatore intende intrattenere. Gli iniettori stessi devono solo essere 18 a 25 paia di basi. Il frammento di DNA generato dai primer in una PCR è denominato un amplicone. La dimensione amplicone può essere determinata sottraendo la differenza di coppie di basi tra la posizione iniziale del primer senso e la posizione finale del primer anti-senso.

Ricerca di sequenze di primer

A partire all'estremità 5' della sequenza di destinazione, trovare un tratto di DNA circa 18 a 24 paia di basi. Per una migliore efficienza di reazione, la sequenza scelta dovrebbe essere libera di nucleotidi che ripetere o eseguire su. Una volta individuata questa sequenza, scriverlo in 5' a 3' direzione. Avanti, scrivere le lettere per le basi che sono complementari alla sequenza selezionata. La sequenza appena derivata è il primer anti-senso.

Alle estremità 3' della sequenza, è necessario identificare un altro tratto di 18 a 24 nucleotidi che soddisfano gli stessi criteri. Annotare questa sequenza tenendo a mente la direzione è ora 3' a 5'. Ancora una volta, scrivere le lettere per le basi complementari. Questa sequenza è il primer di senso.

Per il senso e antisenso primer, comprendono 3 Gs e/o Cs entro le ultime cinque coppie di basi dell'estremità 3'. Anche essere sicuri che i primer non sono tra loro complementari. Infine, assicuratevi di controllare per il potenziale di formazione di 'haripin', che deriva da un primer pieghevole e base in abbinamento a se stesso.