Clonazione di TOPO è un processo di clonazione che utilizza, in genere, 3' A residui che sono termodinamicamente instabili e li combina con una Taq DNA polimerasi. Inoltre, il processo utilizza un prodotto di reazione a catena di fresco della polimerasi (PCR) che deve essere conservato a 4 gradi Celsius. Questa forma di clonazione ottimizza la topoisomerasi attivo ho aggiunta alla fine di un vettore lineare della molecola. Per eseguire la clonazione di TOPO, deve essere seguito un determinato protocollo.
Preparazione
Alcuni passaggi di base possono essere adottati per accelerare il TOPO nel complesso processo di duplicazione e contribuire a garantirne il successo. In primo luogo, tubi di cellule vitali devono trovarsi sul ghiaccio per mantenere la loro accettabilità. Successivamente, il terreno di coltura super ottimale (SOC), arricchita con sostanze nutrienti, la crescita batterica dovrebbe essere portato a temperatura ambiente. Le piastre selettive dovrebbero quindi essere pre-riscaldate a 37 gradi Celsius, quindi sono completamente pronti quando arriva il momento di usarli.
Combinare gli ingredienti
Per iniziare il processo di clonazione, una combinazione di 2 microlitri di prodotto della polimerasi reazione a catena (PCR), 0,5 microlitri di soluzione salina e 0,5 microlitri di vettore di clonazione dovrebbero essere combinati in una provetta da centrifuga da 0,5 millilitri. Una volta combinati, questi ingredienti dovrà essere impostata a temperatura ambiente e lasciata incubare per cinque-dieci minuti. Successivamente, verranno aggiunta al "Top-10 cellule chimicamente competenti" in un tubo di 50-microliter ingredienti combinati e posti su ghiaccio per altri dieci minuti. Dopo questo, le cellule devono essere calore scioccato a 42 gradi Celsius esattamente e posti su ghiaccio per un minuto prima di 180 microliters del mezzo SOC è aggiunto. Questa miscela deve essere agitata quindi in senso orizzontale a 200 giri/min per un'ora aggiuntiva a 37 gradi centigradi.
Fasi finali
Una miscela di 50 microlitri e 100 microlitri di ciascuna reazione dovrebbe essere placcata out "sul LB + AMP + X-Gal piastre e incubare senza agitare durante la notte a 37 C." Il giorno successivo le tre colonie bianche da ogni reazione dovrebbero essere scelto e posizionate in 4 ml di LB + AMP e sinistra per incubare durante la notte ad una temperatura di 37 gradi Celsius mentre scosso a 200 giri/min. Il passo finale è la mini-preparazione di plasmidi e in attesa di vedere se il processo è stato completato.