Il passo chiave per eseguire un esperimento di analisi della proteina di successo sta preparando un lisato cellulare di alta qualità. Western blot sono alcuni degli esperimenti di analisi di proteine più comuni eseguiti nei laboratori di ricerca biologica, e preparazione del lysate delle cellule è il primo passo. Proteomica e analisi delle proteine permetterà agli scienziati di sapere sulle funzioni delle proteine nei sistemi biologici.
Istruzioni
• Indossare guanti prima di maneggiare i materiali o attrezzature.
• Preparare il tampone di lisi unendo gli ingredienti elencati in "Cose avrai bisogno". Regolare il pH del buffer a 6,8 con acido cloridrico.
• Raffreddare il buffer di lisi. Se il buffer di Lisi è preparato un giorno o più in anticipo, raffreddare in frigo. In caso contrario, raffreddarlo bene per 1 ora su ghiaccio.
• Aggiungere 1,5 mL di coltura delle cellule in sospensione in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
• Girare il tubo a 3200 giri al minuto (RPM) per 2 minuti nella centrifuga. Filatura farà sì che le cellule formare una pallina nella parte inferiore del tubo. Il terreno di coltura cellulare dovrebbe essere traslucido alla fine del ciclo di centrifuga.
• Eliminare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet nella parte inferiore del tubo.
• Risospendere il pellet in 150 µ l di tampone di lisi refrigerati. Questo aiuta a solubilizzare il pellet di cellule e inizia il processo di rottura delle membrane cellulari.
• Aggiungere perline di vetro per aumentare il volume totale nel tubo da 0,3 mL. Le perline causerà ulteriore aggregazione della cella a pellet quando nel Vortex.
• Vortice del tubo Vortex a tutta velocità per 1 minuto.
• Raffreddare il tubo per 30 secondi sul ghiaccio. Evitare di esporre il tubo per temperature calde per lunghi periodi come questo può portare a degradazione della proteina.
• Vortice il tubo nuovo a tutta velocità per 1 minuto.
• Centrifugare la provetta a 2400 giri/min a tirare la cella lysate costituenti in una pallina nella parte inferiore del tubo.
• Conservare lisati cellulari nel freezer.