L'esperimento di patch-clamp è utilizzato per misurare le cellule viventi singolo. Lo fa con una pipetta molto fine tenuta strettamente contro singola membrana delle cellule (il rivestimento protettivo esterno). L'apertura di questa pipetta è solo circa 1 micron (un millesimo di millimetro) ed è controllata otticamente con un microscopio. Le cellule sono tenute uniforme in un piatto utilizzando un separatore cellulare, quali tripsina. Una cella specifica è scelto e la punta della pipetta è posto sulla membrana cellulare. La tenuta è formata mediante aspirazione e parte della membrana viene disegnato nella pipetta.
Istruzioni
• Ottenere un piatto per le cellule. Lavare la piastra due volte con 10 ml di PBS (tamponato fosfato salino) senza calcio e magnesio. Aggiungere 2 millilitri di Distaccatore (tripsina). Incubare la piastra per tre minuti a 37 gradi centigradi. Osservare la piastra sotto il microscopio per garantire che le cellule hanno staccato. Muovere delicatamente la piastra per staccare tutte le celle dalla parte inferiore della piastra. Aggiungere 10 millilitri di HEK (keratinocyctes epidermico umano) e FCS (siero fetale mucca) medie. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per spostare le celle su e giù.
• Osservare le cellule sotto il microscopio per garantire che essi sono cellule singole. Pipettare con la pipetta 10-millilitro fino a quando le celle sono singole, se necessario. Centrifugare le cellule per due minuti a 1.000 giri al minuto. Scartare il surnatante. Posizionare le cellule in 10 millilitri di siero fetale di vitello. Centrifugare le cellule ancora per due minuti a 1.000 giri al minuto. Scartare il surnatante. Posizionare le cellule nel 200 microlitri di soluzione di registrazione esterna. Osservare le cellule sotto il microscopio per singole celle con una membrana liscia.
• Posto la soluzione salina all'interno di un chip di patch clamp. Aggiungere una goccia di soluzione elettrolita intracellulare alla parte inferiore del chip utilizzando una pipetta. Montare il chip su un tappo di torsione. Il tappo twist dovrebbe contenere l'elettrodo di riferimento e la linea di aspirazione. Aggiungere una goccia di soluzione elettrolitica extracellulare nella parte superiore del chip utilizzando una pipetta. La soluzione elettrolitica permette per il chip di fare contatto con l'elettrodo. Aggiungere 5 microlitri di sospensione cellulare alla soluzione salina nel chip. Posizionare una singola cella usando aspirazione attraverso una pipetta. Aspirazione possa essere eseguiti manualmente aspirando l'aria attraverso la pipetta. Posizionamento della cella aumenta la resistenza per formare un sigillo. Il sigillo consente per indagine su tutta la cella.