Introduzione alla clonazione
Clonazione molecolare è il processo di creazione di copie di un pezzo di informazione genetica per un'ulteriore analisi. Questo processo avviene trasferendo un pezzo di DNA da un organismo in una molecola in grado di riprodurre copie del DNA trasferito. La molecola più spesso utilizzata per effettuare copie di DNA nella clonazione molecolare è una sostanza chiamata un plasmide batterico. Plasmidi sono indipendenti forme di vita che non è necessario essere nei batteri ospite per generare copie di DNA. Tecniche di clonazione molecolare sono utilizzate frequentemente in laboratorio e sono stati in uso fin dalla loro scoperta nel 1970.
Trasferimento e isolamento del DNA
Prima che il DNA in fase di studio può essere inserito in un plasmide deve prima essere isolato, separato forma il resto del DNA e suddivisi in frammenti. Il primo passo in questo processo, l'isolamento della sezione del DNA che verrà replicata, è fatto usando una varietà di tecniche, la più comune delle quali è chiamato reazione a catena della polimerasi o PCR. Il metodo PCR non solo consente di isolare un pezzo di DNA, aumenta anche la quantità di DNA disponibile. Questa porzione amplificata del DNA è poi inserita in un plasmide (o altri simile vettore) e trattata con enzimi specializzati che preparano il DNA per la replica. Questi enzimi suddividere il DNA in frammenti lineari ed elaborano questi frammenti in filamenti di DNA che contengono solo il DNA di interesse. Il plasmide trasformato è ora pronto per il trasferimento.
Trasfezione
Il plasmide preparato successiva viene trasferito in una cellula di batteri ospite attraverso un processo chiamato transfezione. Transfezione è più spesso fatto utilizzando un processo chiamato elettroporazione, anche se ci sono una serie di tecniche che può realizzare la transfezione. Elettroporazione funziona aumentando la permeabilità delle cellule host utilizzando un campo elettrico per creare pori nella parete delle cellule. I batteri che contengono il plasmide trasformato vengono poi trasferiti su una piastra di crescita dove vengono coltivate le colonie delle cellule.
Identificazione e la conferma del successo
I processi coinvolti nella creazione di un clone molecolare non sono affatto efficienti. Prima del trasferimento alla piastra di crescita i batteri sono contrassegnati in modo che i batteri che contengono il DNA desiderato possono essere identificati visivamente con un indicatore di colore o in modo che solo quei batteri con il DNA desiderato sono in grado di crescere. Le colonie che si sviluppano quindi sono testate per assicurare che il DNA desiderato è presente. Una volta che la sequenza di DNA è confermata che i batteri possono quindi essere utilizzati per studi investigativi.