Come fare una reazione di legatura

Come fare una reazione di legatura

Legatura del DNA è una reazione chimica, aiutata da un enzima chiamato ligasi. Ligasi agisce unendo pezzi di DNA. In particolare, ligasi crea un legame fosfodiestere tra una molecola di DNA, noto anche come un nucleotide e un altro nucleotide. In un sistema biologico, ligasi del DNA ripara e rimette insieme filamenti di DNA. In laboratorio, ligasi permette l'inserimento di parti del DNA stranieri in filamenti di DNA.

Istruzioni

• Calcolare l'importo dell'inserto di DNA da utilizzare. Moltiplicare 2 per il numero di coppie di basi dell'inserto di DNA e quindi di 50 nanogrammi (ng) di filo del DNA. Poi, dividere per il numero del filo del DNA di coppie di basi. Ad esempio, se l'inserto di DNA ha 20 coppie di basi, è possibile moltiplicare 20 per 2 e poi da 50 ng di ottenere 2000 ng. Quindi, se il filamento di DNA ha 100 paia di basi, dividere 2000 ng per 100 per ottenere 20 ng di inserto del DNA.

• Scongelare i buffer di legatura X 2 a temperatura ambiente. Aggiungere 50 ng DNA strand, 20 ng DNA inserto, 3 microlitri acqua sterile, 5 microlitri 2 x buffer di legatura e 3 unità di T4 DNA ligasi un piccolo tubo Eppendorf.

• Richiudere la provetta Eppendorf e consentire la reazione di legatura procedere a temperatura ambiente per cinque minuti.

Consigli & Avvertenze

  • Tenere la ligasi del DNA T4 fonte sul ghiaccio durante l'uso. Permettendo la ligasi a caldo può danneggiare l'enzima. Ligasi del DNA T4 è il più comunemente usato ligasi in laboratorio e prende il nome da batteriofago T4, un virus che digerisce i batteri.
  • 2 X legatura buffer è una soluzione di reazione che è possibile acquistare da fornitori di laboratorio. Contiene sostanze chimiche che mantenere il pH della reazione a un livello accettabile.
  • Un tubo Eppendorf è un tubo di plastica da 1,5 ml con cappuccio collegato. È il tubo di reazione più comunemente usati disponibile.