Gli iniettori sono brevi, singoli incagliati frammenti sintetici di DNA usata per la clonazione. La reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzata per la clonazione è costituito da tre passaggi: denaturazione (il DNA di interesse è separato in due filoni separati), ricottura (il primer si attacca al gene di interesse) ed estensione (DNA polimerasi estende il primer per clonare il DNA di interesse). Buon primer design è essenziale per la clonazione efficiente. Ci sono molti fattori da prendere in considerazione quando si progetta il primer Ottimo per il gene di interesse.
Istruzioni
Fattori da considerare nella progettazione degli iniettori
• Scegliere una sezione di coppie di basi all'inizio e alla fine del tuo gene per il primer forward e reverse. Ogni primer sarà complementare alla relativa sezione. Ricordate, il DNA è sintetizzato da estremità 5' a 3' fine, così il vostro primer 5' avanti deve essere complementare al tuo filo inferiore, e il vostro primer 3' inversa deve essere gratuito per il filo superiore.
• Progettare il primer per essere 18-21 nucleotidi di lunghezza. Questo aiuta a prevenire il legame non specifico del primer, garantendo la sequenza è complementare alla sola sezione, ma contiene ancora una lunghezza sufficiente per temprare correttamente.
• Disegnare primers per avere una temperatura di fusione di 50-60 gradi Celsius. Una formula semplificata per stimare la temperatura di fusione di un primer è T = 2 (A + T) + 4 (G + C).
• Disegnare primers quindi contenere 40-60 per cento dei nucleotidi di G e C. In tal modo che la temperatura di fusione è abbastanza alta. Garantire che le temperature di fusione di ogni coppia di primer sono all'interno di 5 gradi uno da altro.
• Evitare la complementarità delle due o tre basi alle estremità 3' dei primer. Questo riduce la formazione di primer-dimero, che si verifica quando i primer temprano a vicenda invece di gene di interesse.
• Progettare un morsetto di GC in vostri iniettori. Mettere basi G e C entro le ultime cinque basi dall'estremità 3' di ogni primer. Questo favorisce il legame specifico all'estremità 3'. Si tratta di un legame più forte delle basi G e C. Evitare più di tre G o di C nelle ultime cinque basi all'estremità 3' di ogni primer.
• Evitare di mettere una T all'estremità 3' del primer. Questi iniettori hanno una maggiore tolleranza di mancata corrispondenza.
• Evitare ripetizioni consecutive di 2 paia di basi (nucleotidi di ripetizioni) come questo può causare mispriming. Quattro o meno ripetizioni di nucleotidi sono ideali.
• Evitare i tratti di una singola base come questo può anche causare mispriming. Evitare ripetute più di quattro basi di fila.