Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) ha numerose applicazioni nelle analisi di laboratorio. Come un preludio all'esecuzione di un'analisi vera e propria, è importante calibrare un sistema HPLC, compreso la colonna cromatografica, che produce la separazione degli analiti chimici. Calibrazione assicura che vari analiti possono essere identificati dal loro tempo di permanenza all'interno della colonna così come quantificati secondo la grandezza della loro risposta del rivelatore.
Istruzioni
Calibrazione di colonna HPLC
• Decidere i parametri del metodo HPLC in cui saranno calibrare la colonna. Questi includeranno fattori quali il solvente particolare fase mobile utilizzato, la portata del solvente, il tipo di rivelatore sistema e le impostazioni del rivelatore, come pure la sostanza chimica che prova per (l'analita). Spesso può essere utilizzato un metodo esistente, ad esempio uno specificato da un organismo di regolamentazione (la Environmental Protection Agency, per esempio).
• Preparare una serie di soluzioni di taratura standard. Questi sarà preparati sciogliendo gli importi aumentanti dell'analita chimica in un solvente adatto. Il solvente verrà specificato dal metodo, o spesso lo stesso solvente utilizzato per la fase mobile può lavorare per sciogliere l'analita. Un set di calibrazione tipico consisterebbe di cinque o sei soluzioni, che coprono un intervallo di concentrazioni da zero a 100 parti per milione.
• Accendere l'HPLC e relativi componenti associati, come fase mobile pompa, rivelatore e computer di acquisizione dati.
• Collegare l'ingresso di colonna per la riga di output pompa solvente e collegare l'uscita della colonna con la linea di ingresso del rivelatore.
• Avviare la pompa per iniziare il flusso della fase mobile attraverso la colonna con la frequenza specificata dal metodo. In assenza di un metodo standard, una portata di 1 o 2 millilitri al minuto è tipica.
• Iniettare l'HPLC, uno alla volta, dalla più bassa alla più alta concentrazione di ogni soluzione di analita standard. Il metodo specificherà il volume da iniettare, o si può utilizzare un volume tipico di 20 a 50 microlitri.
• Per ogni iniezione, osservare la traccia di uscita rivelatore del computer di acquisizione dati. Quando l'output del rivelatore Mostra un evidente picco in risposta all'analita uscendo la colonna e passando attraverso il rivelatore, smettere di acquisizione dati, salvare il file di dati elettronicamente e iniettare il campione successivo.
• Dopo tutti i campioni vengono iniettati e viene salvato un file di dati di risposta rivelatore per ognuno, è possibile utilizzare il software di acquisizione dati per integrare le cime per ogni file determinare il tempo di ritenzione per l'analita e l'area dei picchi per ciascuna iniezione.
• Confrontare i tempi di conservazione per tutte le iniezioni garantire che essi sono tutti abbastanza vicini l'uno a altro (all'interno di circa più o meno 5 per cento). Registrare questo come il tempo di ritenzione per quell'analita su tale colonna per facilitare in futuro l'analisi dei campioni sconosciuti.
• Utilizzando il software di acquisizione dati, o un programma come Excel, inserire una serie di punti di dati composto dalle concentrazioni di analita soluzione standard e le aree dei picchi corrispondenti. Disporre del software di generare un'equazione lineare concernenti i due sotto forma di: Area di picco = (m)(Concentration) + b, dove m è la pendenza e l'intercetta di b. Questa è l'equazione di taratura per quell'analita su tale colonna.
Consigli & Avvertenze
- Nota che la calibrazione effettuata qui dipende anche la strumentazione HPLC associata, come il rivelatore e la pompa. Se la colonna viene spostata in un altro HPLC o se condizioni come solvente portata sono cambiate, la taratura deve essere ripetuta.
- Tempi di ritenzione possono cambiare nel tempo a causa di vari fattori come usura di colonna. Il HPLC deve essere ricalibrato spesso anche se non vengono apportate modifiche allo strumento o metodo.