Come analizzare i dati di Western Blot

02/15/2014 by admin

Western blot è una tecnica di elettroforesi del gel che analizzano il contenuto proteico di un campione biologico. Questa tecnica è una procedura standard nei laboratori di ricerca biologica e può essere utilizzata anche in medicina legale o diagnostica biomedica.

Western blot prendere proteina purificata da un campione di tessuto e soggetto a un processo chiamato SDS PAGE, dove le proteine sono separate in peso utilizzando una corrente elettrica. Una volta che le proteine sono separate, può essere trasferiti ad una membrana di difluoruro di polivinile (PVDF) e analizzate per varie proteine di interesse.

Istruzioni

Sviluppare un Gel di Western Blot per una proteina di interesse

• Lavare accuratamente la membrana PVDF in soluzione TBST. Posizionare la membrana in un contenitore rettangolare riempito con TBST e posizionarlo su un agitatore di inclinazione o rotazione a bassa velocità (80-90 hertz) per 10 minuti. Dump TBST fuori e ripetere questo lavaggio.

• Lavare la membrana in tampone bloccante. Attentamente versare la soluzione TBST e versare una quantità equivalente di tampone bloccante nel contenitore. Posizionare il contenitore su un agitatore a velocità bassa per un'ora.

• Mescolare il vostro anticorpo primario durante l'attesa per il tampone bloccante completare. Controllare il vostro anticorpo per vedere quale diluizione è consigliato dal produttore e diluire in conseguenza. Per esempio, se il vostro anticorpo deve essere mescolato in una diluizione di 1:5,000, si può misurare 10 ml di tampone di arresto e aggiungere 2 µ l (microlitri) di anticorpo primario.

• Versare il tampone bloccante e aggiungere la soluzione di anticorpo primario al contenitore. La quantità di tempo necessaria per incubare l'anticorpo primario con la membrana PVDF varierà con il campione dell'anticorpo e del tessuto. La procedura più comune consiste nell'inserire la membrana su un agitatore a velocità lenta a 4 gradi C (in frigorifero) per 16-18 ore. Il vostro anticorpo dovrebbe venire con un tempo di incubazione consigliati.

• Risciacquare la membrana PVDF. Eliminate l'anticorpo primario e risciacquate la membrana per 10 minuti in TBST a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio due o tre periodi di lavaggio.

• Incubare la membrana in anticorpo secondario. Il vostro anticorpo secondario viene fornito con una diluizione raccomandata. Per esempio, se la diluizione raccomandata è 01.10, 000, è possibile aggiungere 1 µ l a 10 ml di tampone bloccante. Assicurarsi che il vostro anticorpo secondario è etichettato come "HRP-coniugato" perché altri anticorpi potrebbero non funzionare correttamente con kit ECL.

• Sviluppare la membrana PVDF con ECL o un sistema di chemiluminescenza comparabili. Controllare le istruzioni fornite con il kit ECL per vedere come miscelare la soluzione di sviluppo e come sviluppare correttamente la membrana.

Sviluppare la membrana PVDF

• Esporre una pellicola alla membrana. Entro 10-15 minuti di ECL in via di sviluppo, è necessario portare la membrana PVDF per una camera oscura. In completa oscurità, esporre una pellicola in bianco alla membrana e inserirlo nella macchina in via di sviluppo di camera oscura.

• Una volta che il film esce lo sviluppatore, accendere le luci e vedere se la pellicola è adeguatamente sviluppata. Se il film è troppo chiaro, sarà necessario esporre un nuovo film per un tempo più lungo. Se il film è troppo scuro, si può provare a esporre un altro film per un minuto o 30 secondi.

• Nota il tempo di esposizione che ha creato un film ben sviluppato. È possibile utilizzare questo tempo per tutte le esecuzioni successive di questa procedura.

• Digitalizzare la pellicola sviluppata in un computer che utilizza lo scanner. Con la maggior parte degli scanner, potete posizionare la pellicola sul piano dello scanner e premere un pulsante. Consultare la documentazione fornita con lo scanner per determinare se questa è la procedura corretta. Una volta che il film viene scansionato in, è possibile salvare l'immagine con un nome di file descrittivo che si sarà in grado di riconoscere più tardi.

• Aprire l'immagine salvata nel programma ImageJ. ImageJ è sviluppato dai National Institutes of Health (NIH) ed è disponibile gratuitamente online.

Confronta le bande sulle pellicole sviluppate

• Ottenere una misurazione di sfondo. Effettuare una selezione rettangolare intorno alla banda più grande in Western blot utilizzando lo strumento di selezione (la prima icona sulla barra degli strumenti). Quindi spostare il rettangolo in un'area vuota e non sviluppata del film. Tenere premuto Control + M per misurare l'oscurità di sfondo.

• Spostare il rettangolo per la prima band sulla pellicola e premere nuovamente controllo-M. Ripetere questa sequenza per tutte le bande sul film che si desidera analizzare.

• Copiare i dati di banda. Quando si avvia la misurazione, apparirà una finestra "Risultati". Una volta che hai finito di misurazione, evidenziare tutti i dati di misura e premere Control-C per copiarlo. Aprire il tuo programma di foglio di calcolo e premere CTRL + V per incollare i dati di misurazione. Attentamente etichetta dati tutti incollati e salvare il file di dati quando hai finito tutte le pellicole di misura.

• Determinare la densità di ciascuna banda. Il valore per la vostra misura di sfondo dovrebbe essere il numero più alto dal momento che è più le bande ombreggiate il Western blot film brillante. Sottrarre i valori di misurazione di banda dal valore di background per determinare la loro densità relativa. Per esempio, se il valore di sfondo è 200 e si dispone di quattro bande con valori di luminosità di 150, 170, 180 e 190, i valori finali per quei quattro bande sono 50, 30, 20 e 10.

• Confronta i gruppi sperimentali utilizzando qualunque analisi statistica che si desidera applicare. Maggior parte degli esperimenti utilizzano una tecnica chiamata ANOVA (analisi della varianza) per confrontare i valori tra gruppi. Molti pacchetti di statistiche quali PSAW hanno procedure statistiche incorporato per eseguire ANOVAs sui dati formattati correttamente.

Consigli & Avvertenze